病毒滅活試驗(yàn)

病毒,一類嚴(yán)格的細(xì)胞內(nèi)寄生物。在宿主細(xì)胞外環(huán)境，病毒既不能獨(dú)立進(jìn)行代謝活動(dòng)，也不能進(jìn)行繁殖，只能以顆粒形態(tài)存在，即病毒體(virion)的形態(tài)存在。病毒死亡，由蛋白質(zhì)外殼的分裂和核酸退化導(dǎo)致的病毒濃度隨時(shí)間的降低。死亡的病毒不會(huì)感染宿主細(xì)胞, 因而喪失對人畜健康危害（沒有生物活性，不能主動(dòng)進(jìn)入細(xì)胞，也不能在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制）。清除病毒的方法有很多，按病毒去除/滅活方式的不同，可分為有機(jī)溶劑/去污劑(S/D)法、低pH值孵放法、膜過濾法、紫外法、超短時(shí)微波加熱法、巴氏消毒法和干熱法等。咨詢電話: 13816144967 (微信同號)

1. 有機(jī)溶劑/去污劑病毒（S/D）滅活法

過去，人們發(fā)現(xiàn)甲肝病毒能通過消化道傳播，乙肝病毒通常不能通過消化道傳播，但是在膽汁分泌障礙人群體內(nèi)，乙肝病毒能通過消化道傳播的概率較高。后來，科學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，這與膽汁能溶解乙肝病毒的脂包膜有關(guān)。根據(jù)以上原理，通過研究和臨床觀察發(fā)現(xiàn)，使用Triton-X 45這類的非離子型表面活性劑（去污劑）和磷酸三丁酯（有機(jī)溶劑）能夠有效破壞類似乙肝病毒的類脂膜：類脂從病毒表面脫落，使病毒失去黏附和感染細(xì)胞的能力，從而達(dá)到滅活病毒的效果，且對蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)的影響也非常小。這種方法就是有機(jī)溶劑/去污劑病毒（S/D）滅活法。

因S/D法具有較高病毒去除作用、蛋白相容性高、易于插入到現(xiàn)有或新開發(fā)的純化工藝中等優(yōu)點(diǎn)，人們便將這種滅毒方法用于血漿、血液制品和生物制品。S/D法作為血漿病原體滅活技術(shù)，是最早得到醫(yī)療界的認(rèn)可，并投入臨床中的。因?yàn)镾/D法滿足了以下三點(diǎn)：①能完全有效滅活胞內(nèi)、胞外病原體及附著在細(xì)胞上的病原體；②所選試劑能選擇性地進(jìn)入細(xì)胞且不損傷細(xì)胞；③經(jīng)處理后的紅細(xì)胞不產(chǎn)生新抗原或者抗體，對人體無害。因?yàn)镾/D病毒滅活處理對多種不同的包膜病毒都能發(fā)揮有效的病毒滅活作用,且有良好的臨床安全性，因此其通過美國FDA許可,以用于濃縮的人血液Ⅷ因子的病毒滅活,并已廣泛用于生物制品的生產(chǎn)。

在工藝操作過程中需要注意：本方法對于無脂包膜類病毒作用微弱（僅部分非脂包膜病毒有效），但在工藝中的低pH（如pH 4）處理（有時(shí)加胃酶）能滅活幾種脂包膜病毒。除此之外，病毒滅活效果可能受pH值、孵放時(shí)間和溫度、胃酶含量、蛋白質(zhì)濃度、溶質(zhì)含量等因素影響。隨著pH升高，滅活效果降低，隨著溫度升高，滅活效果升高，通?？梢赃_(dá)到5~6LRV滅活效果。在pH 3.7、pH 3.8時(shí)，其滅活效果會(huì)受多因素干擾。而樣品中含有一定量的精氨酸時(shí)可以改善病毒滅活效果，即使在pH 4.0的條件下也有顯著的滅活效果。低pH孵放不僅可以滅活有脂包膜類病毒，還可以沉淀HCP、DNA等雜質(zhì)，對純化工藝中的雜質(zhì)去除也起到重要作用。咨詢電話: 13816144967 (微信同號)

2. 納米膜過濾技術(shù)

納米膜過濾技術(shù)是一種通過孔徑大小過濾來濾除病毒的技術(shù)，多用于血液制品和生物制品中的病毒去除，其可以有效去除非脂包膜病毒。作為生物制品凈化過程中最常用的技術(shù)之一，其目的是達(dá)到有效的凈化效果，保證生物制品的安全。得益于生物治療產(chǎn)品如單克隆抗體、干細(xì)胞產(chǎn)品、血液成分、生物制劑和疫苗不斷增長的需求，未來幾年全球病毒過濾市場預(yù)計(jì)呈現(xiàn)增長的趨勢。

納米膜過濾是利用病毒和蛋白大小的不同，小于平均孔徑的蛋白通過濾膜，大于平均孔徑的病毒截留在膜內(nèi)，從而達(dá)到去除病毒的效果。納米膜過濾可以同時(shí)滿足病毒去除效果好、目的蛋白質(zhì)通過性高（回收量、過濾時(shí)間）、目的蛋白質(zhì)不變性的特點(diǎn)，另外不管是脂包膜病毒還是非脂包膜病毒，無論病毒基因組是RNA還是DNA，基本靠孔徑大小來去除病毒，所以是當(dāng)前最可靠的病毒去除、滅活技術(shù)。根據(jù)目的蛋白的大小，可以選擇平均孔徑不同的濾膜。在濾過產(chǎn)品中，平均孔徑為20 nm左右的產(chǎn)品被稱為細(xì)小病毒濾膜。近年來，由于去除小病毒的需求的提高，這種產(chǎn)品得到了廣泛的應(yīng)用。其中平均孔徑35~50 nm的濾膜被稱為逆轉(zhuǎn)錄酶病毒濾膜。

在實(shí)際的生產(chǎn)過程中，為了提高蛋白回收率，需要暫停壓力，然后將流路切換到清洗緩沖槽進(jìn)行后沖洗。病毒過濾的最劣條件之一是高TMP（跨膜壓差）。近年來的報(bào)告表明，過濾過程中壓力的釋放及之后的再加壓都會(huì)影響病毒去除效果。特別是在添加細(xì)小病毒和噬菌體進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)中，在壓力暫停后再次加壓，會(huì)從濾液中檢測出病毒粒子。這種現(xiàn)象不是某種病毒濾膜所特有的，而是所有病毒濾膜產(chǎn)品的普遍現(xiàn)象。發(fā)生這種現(xiàn)象的原因在于，暫停壓力后，被截留在膜內(nèi)的病毒粒子會(huì)再進(jìn)行布朗運(yùn)動(dòng)，離開膜壁，再次加壓后，附近若有粒徑較大的濾孔，病毒粒子又會(huì)通過而漏出膜外。當(dāng)然，這不意味著病毒粒子一定會(huì)漏出。病毒漏出與否、漏出量取決于過濾對象溶液的性質(zhì)、過濾壓力、壓力暫停時(shí)間、病毒種類、病毒滴度/量和病毒濾膜的種類。咨詢電話: 13816144967 (微信同號)